GOクラブでは、2012年、2013年と年末に次世代シーケンサーの分類および各機種の状況について紹介してきた。今回の記事では、昨年に引き続き、2014年末時点での主な第２世代、第３世代（第４世代と呼ばれるものも含める）シーケンサーの原理・特徴ならびに市販・開発状況に関してまとめたので、紹介する。
主な第２世代シーケンサー
DNA合成・光検出法を用いた超並列シーケンシング
GOクラブでは、DNAポリメラーゼまたはDNAリガーゼによる逐次的DNA合成法を用いて、蛍光・発光の光検出により、超並列的に塩基配列決定を行う技術をもとにしたシーケンサーを「第２世代シーケンサー」として分類してきた。現在発表されている主なものを下に示す。第２世代シーケンサーは、DNA増幅などを含めたサンプル調整や、光検出を行うための試薬や検出器を必要とするため、コストが高くなりがちである。しかし、近年では性能の向上とランニングコストの低減も、技術の進歩とともに進められている。
| ステータス | 開発企業／機関 | 原理・特徴 | 販売・開発状況 |
| １．発売済 | Roche-454 | DNA合成時に放出されるPyrophosphateを検出する技術（Pyrosequencing）を実用化し、世界で初めて次世代シーケンサーを市販した。 | 最新の機種はGS FLX+ システムとGS Junior システムの２種類が利用できる。ただし、2016年内にシーケンサービジネスを終了する予定である。 |
| １．発売済 | Illumina | 逐次DNA合成型で取り込まれた塩基を４色の蛍光色素で検出する。新しい機種NextSeq500では、２色蛍光色素で塩基を同定する方法を用いている。 | 現在販売されている機種は、MiSeq, NextSeq 500, HiSeq 2500, HiSeqX Tenの４種類で、HiSeqXTenは1000ドルゲノムを達成した機種である。 |
| １．受託解析として利用可能 | Complete Genomics | DNAを増幅した後、蛍光色素を付与したオリゴマーをライゲーション反応により結合していくことにより、配列を決定する。 | 中国企業BGIに買収された。ヒト全ゲノムおよびエキソーム解析の受託サービスのみ提供している。 |
| １．受託解析として利用可能（過去に発売済） | SeqLL (Helicos Biosciences) | １分子DNA/RNAを鋳型として逐次型DNA合成を行い、塩基取り込みを蛍光で検出する。１分子でシーケンシングできるので、第３世代の特徴も併せ持つ。 | Helicos Biosciencesは2012年11月に破産により事業を中止した。その後、2013年3月にSeqLL, LLC がHelicosの資産を承継し、受託シーケンシングサービス事業を開始することをアナウンスした。 |
| １．発売済（現在はほとんど売れていない） | Life Technologies (SOLiD) | 蛍光色素を持つオリゴDNAをライゲーション反応により結合していくことで配列を決定する。 | SOLiDシーケンサーと呼ばれる機器が利用されていたが、最近ではほとんど売れなくなったと思われる。 |
| １．発売済（現在はほとんど売れていない） | Danaher Motion Polonator | 蛍光色素を持つオリゴDNAをライゲーション反応により結合していくことで配列を決定する。 | OpenSourceシーケンサーとして一時期話題になったが、現在はほとんど使われていないと思われる。 |
| ２．シーケンサー完成＆今後発売予定 | QIAGEN-Intelligent Bio-Systems | Reversible terminatorsを用いて逐次DNA合成と蛍光検出で配列を決定する。 | QIAGENがIntelligent Bio-Systemsの技術とシーケンサーを買収し、今年GeneReaderという製品名でシーケンサーを発売する予定であったが、発売を延期した。 |
| ２．シーケンサー完成＆今後発売予定 | GnuBIO | 解読したいDNAに対して6-merのオリゴDNAをハイブリダイズさせて、その6-merの存在を蛍光で検出する仕組み（Sequencing-By-Hybridization）法により配列を決定する。 | 今年（2014年）シーケンサーが発売される予定であったが、Bio-Rad Laboratories, inc.によって買収された後、シーケンサーの発売は延期された。 |
| ３．開発中止 | Lightspeed Genomics | 蛍光を高速かつ高精度にスキャニングする技術を用いたシーケンシング法の開発を進めていた。 | シーケンサーの開発は中止された。 |
| ３．開発中止 | LaserGen | 光（ＵＶ）照射により切断可能な蛍光色素を持つヌクレオチドである“Lightning Terminator”を用いて、DNAポリメラーゼにより１塩基ずつ逐次合成して配列を決定する。 | シーケンサーの開発は中止された。 |
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主な第３世代シーケンサー
GOクラブでは、主に以下の２つの原理によるものを「第３世代シーケンサー」と分類してきた。
１分子リアルタイム・シーケンシング
DNA１分子を鋳型としてDNAポリメラーゼによるDNA合成を行い、蛍光・発光などの光で１塩基ごとの合成反応を検出することにより、リアルタイムで塩基配列を決定するシーケンシング技術。この方法は、DNAポリメラーゼの合成速度で塩基配列を読むために、単位時間当たりの配列決定量も大きいのが特徴である。
Post-light シーケンシング
ナノポアを用いる方法、または光検出以外の検出方法を用いることによる、超並列的な塩基配列決定技術が多数開発されている。ナノポア・シーケンシング技術の中には、蛍光検出を利用するものもあるが、光検出を行わない場合には、試薬代が安価になり、光検出器が必要なくなるため、機器も安価になることが期待されている。またDNAサンプル調製もより簡便になると思われる。
| ステータス | 開発企業／機関 | 原理・特徴 | 販売・開発状況 |
| １．発売済 | Pacific Biosciences | １分子DNAを鋳型としてDNAポリメラーゼが蛍光色素を持つヌクレオチドを取り込むときに、蛍光を検出して配列を決定する。 | Pacbio RS II DNA Sequencing Systemを発売しており、特にロングリードの用途で用いられている。 |
| １．発売済 | Life Technologies/Ion Torrent Systems | 半導体センサーを用いて塩基の取り込みに伴うpH変化の検出により配列を決定するPyrosequencerを開発し、市販している。 | 最大2 Gbの配列出力を有するIon Torrent PGMシステムと最大10 Gbの配列出力を有するIon Protonシステムが販売されている。 |
| ２．機器が利用可能な段階に到達 | NABsys | １本鎖の鋳型DNAに対してオリゴDNAをハイブリダイズさせた後、オリゴDNAのハイブリダイゼーションにより生成した２本鎖領域をソリッドステートナノポアを通して検出する技術を開発した。ただし、シーケンサーの開発までには至っていない。 | DNAの大きな構造変化を検出できる分析機NPS 8000（DNAシーケンサーではない）を2013年に発表したが、まだ市販に至っていない。 |
| ２．機器が利用可能な段階に到達 | Oxford Nanopore Technologies | ２本鎖DNAをDNAポリメラーゼを用いて解きほぐし、片方の１本鎖DNAをプロテインナノポアを通過させたときに電流の変化を検知する方法により配列を決定する。 | 世界で初めてナンポアシーケンサーを実用化した。USBメモリー用のナノポアシーケンサーであるMinIONデバイスをアーリーアクセス・ユーザーに配布し、Pacific Biosciencesのシーケンサーに迫る性能が出ることが実証された。さらに上位機種となるPromethIONデバイスのアーリーアクセスプログラムも近々始めることが発表された。 |
| ２．機器が利用可能な段階に到達 | GenapSys | ライブラリー作製からDNAシーケンシングまでの操作をより簡単にし、さらに半導体チップを用いてシーケンシングを行うことにより、iPad程度のサイズのポータブル半導体シーケンサーを開発した。 | すでにシーケンサーのβ版は完成しており、アーリーアクセスユーザーを募集しているが、その進捗状況について不明である。 |
| ３．機器の実用化が近い | Genia （外部サイト） | １本鎖DNAを鋳型とするDNA合成反応に伴ってタグ付き分子が遊離され、そのタグ付き分子がプロテイン・ナノポアを通過するときに、イオン電流変化を検出することにより塩基を読み取る技術（Nano- SBS技術）を開発した。 | RocheがGeniaを買収したことから、シーケンサーの開発は進んでいるものと予想する。 |
| ３．機器の実用化が近い | Base4 Innovations | ２本鎖DNAの３’末端から、ヌクレオチドがPyrophosphateと反応してヌクレオチド-3リン酸（dNTP）が遊離される。このdNTP分子が微小液滴に閉じ込められた後、微小流路を流れる間に、強い蛍光を発するカスケード型化学変化が起こる。この蛍光をナノポアを用いて検出することにより配列を決定する。 | 近い将来IlluminaのHiSeq X Tenを上回る性能を有するシーケンサーが登場する可能性がある。 |
| ４．実用に耐えうる技術を確立 | Stratos Genomics | ターゲットDNAを鋳型として、Xpandomerと呼ぶ長鎖の代理DNAを合成し、この代理DNAがナノポアを通過するときの電流変化を検出することにより配列を決定する。 | Rocheが今年（2014年）6月にGeniaの買収に続いて、Stratos Genomicsシーケンシング技術の開発に投資を行った。 |
| ５．アーリー・ステージ | Quantapore | ターゲットDNAを色素でラベルし、そのDNAをプロテインナノポアを通し、Quantum Dotの機構により発せられる蛍光を検出して、配列を決定する。 | 今年（2014年）５月にシリーズＢファイナンスとして35百万ドル（35～40億円）の資金調達を行ったことから、シーケンシング技術の開発は相当進んでいると思われる。しかしながら、スペックも発表されていないので、アーリーステージにあると評価した。 |
| ５．アーリー・ステージ | Eve Biomedical | 「１分子回転依存性転写シーケンンシング法」と「１分子電界効果トランジスタを用いた転写によるシーケンシング法」の２種類の技術を確立している。 | 原理的には実用性が高い２種類の技術の開発を発表していることから、今後実用化に耐えるシーケンサーを発表する可能性がある。 |
| ５．アーリー・ステージ | Quantum Biosystems | マイクロ流路技術を用いてターゲットDNA分子を分離して、トンネル電極を利用したゲーティングナノポア法により塩基ごとに異なる電流値を検出して配列を決定する。 | 外部への発表も活発であることから、シーケンサーの開発は進展しているものと推測する。ただし、これまで発表されたスペックから評価すると、開発ステージは「アーリー」と思われる。 |
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これまでＧＯクラブで紹介した「次世代シーケンサーの分類」