MALBAC法の概要と原理
 １細胞から調製した染色体DNAをもとにDNAを増幅する新技術であるMALBAC (Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles) の概要を右図にまとめた。 〔セミアンプリコン調製工程〕 １細胞から調製した染色体２本鎖DNA断片（各断片長：10～100 kb）を94℃で3分間加熱し、１本鎖DNAに解離させる。0℃に急冷した後、MALBACプライマー（35塩基の１本鎖DNA＝27塩基の共通配列＋8塩基のランダム配列）とBst DNAポリメラーゼを用いて、鎖置換DNA合成反応を行う。続いて、94℃の加熱処理を加えた後、0℃に急冷する。この反応の結果、右図の場合には、n個のセミアンプリコン（5'側にMALBACプライマーの配列を持つ増幅１本鎖DNA）が生成する。 〔フルアンプリコン調製工程〕 Bst DNAポリメラーゼを追加し、鎖置換DNA合成反応を５サイクル行うが、各反応サイクルにおいて、94℃の加熱処理後は、58℃に温度を低下させる（ルーピング工程）。セミアンプリコンを鋳型として鎖置換DNA合成反応を行うと、新しく合成されたDNAの3'末端側にMALBACプライマーの相補的配列を持つフルアンプリコンが生成する。このフルアンプリコンは、58℃の条件で、MALBACプライマー配列とその相補的配列がアニールしたループ構造を形成し、次の鎖置換DNA合成反応の鋳型とはならない。 〔PCR増幅工程〕 上記のフルアンプリコン調製工程の各反応サイクルでは、セミアンプリコンと元の染色体DNAのみが鎖置換DNA合成反応の鋳型となり、セミアンプリコンが直線状に増えていくので、フルアンプリコンも直線状に増幅され、mサイクル目に生成するフルアンプリコンの量は、m X n X n個となる。 このフルアンプリコン調製工程を５サイクル行った結果、蓄積したフルアンプリコンに対して、MALBACプライマーを用いて通常のPCR反応を18サイクル行うことにより、シーケンシング用２本鎖DNAサンプル（サイズ＝0.5～1.5 kb； DNA量＝μgオーダーで、通常3μg）が得られる。 |
MALBAC法の性能
 ハーバード大学のXie教授らは、SW480 がん株化細胞を用いて、「従来法であるMDA（Multiple Displacement Amplification）法」および「MALBAC法」を用いて１細胞から全ゲノムDNAを増幅し、SOLiD4およびHiSeq2000を用いてシーケンシングを行うことにより、MDA法とMALBAC法の性能比較を行った。対照実験（右表中の「大量の細胞－通常法」）としては、大量のSW480 がん株化細胞から染色体DNAを調製し、シーケンシングを行った。その結果を右表にまとめた。 MALBAC法は、MDA法と比べて、ゲノム全域に渡って均一な増幅が起こるために、決定される配列のゲノムカバー率も向上し、最大93％のカバー率が得られた（上表参照）。上表には結果は示していないが、このシーケンシングの均一性により、CNV (Copy Number Variation) についても、精度高く同定できることも判明した。 SNV (Single Nucleotide Variation) の検出率についても、MDA法と比べて大きく向上している。ただし、False positives、すなわち配列決定エラーについては、かなり高率（～4×10-5）で観察され、その原因はBst DNAポリメラーゼのDNA合成エラーによるものと考えられた。 Xie教授らは、このエラー率を低減させるために、SW480細胞をさらに２個追加して１細胞全ゲノムシーケンシングを行い、塩基の違いが最初の細胞と一致するものを選別したところ、エラー率は、１細胞追加の場合には、10-8となり、２細胞追加の場合には、10-12となった。 |
MALBAC法の応用
| Xie教授らは、MALBAC法の応用例として、99個の精子細胞の１細胞全ゲノムシーケンシングを行い、合計2368箇所の染色体間の交叉・組換え部位を同定できた。精子１細胞あたりの交叉・組換え部位の数は平均26箇所であった。なお、Stanford大学のQuark教授らも、精子細胞（合計91個）の１細胞全ゲノムシーケンシングにより、染色体が交叉し、組み換えが起こった場所を特定し、１精子あたり、平均23箇所の組換えが起こることを発表している（2012年8月21日のGOクラブ記事参照）。 MALBAC法は酵素反応の工夫のみで、特殊な機器も必要としないので、広く利用されるようになるであろう。原理的には、すべての生物種の単細胞ゲノムシーケンシングに適用できるであろう。たとえば、培養困難な微生物のシーケンシングに適用した場合、各微生物細胞につき、平均85％の配列が得られるので、各細胞のゲノム構造の概要は把握できるであろう。さらに、同種の微生物細胞について、もう１細胞の全ゲノム配列が得られれば、配列決定エラー率も低減し、計算上は、決定された配列のゲノムカバー率は約98％となる。 |