7DDNAハプロタイピング法
 (1) 血液を集め、フィトヘマグルチニン（PHA）を加えて、Ｔ細胞を刺激することにより細胞分裂を促す。その後、コルヒチンを添加することにより、細胞分裂をmetaphase（中期）で停止させる。この中期では、凝縮した46本の染色体が紡錘体赤道面に整列していて、各ハプロイドの染色体が分離しやすい状態にある。なお、中期では、各染色体については倍化した2本のハプロイドゲノムはセントロメアで結合している。 (2) 次に、細胞をスライドグラスに固定化し、細胞を溶解すると、46本のハプロイドゲノムが広がった状態になる（図A）。 (3) スライドグラス上の染色体群をLaser Microdissection Microscopeによりレーザービームで分断する。図Bでは約3分の1に分断した例を示した。図Bでは、15本と半分（＝紫色）のハプロイドゲノムが得られているが、黒のゲノムと赤のゲノムは2本ずつあるので、父方のゲノムと母方のゲノムが両方存在することになる。一方、残り11本と半分のハプロイドゲノムは１本ずつしかないので、これらを解析することにより、各ハプロイドのタイピングを行えることになる。 (4) Microdissectionによって得たハプロイド染色体は、Multiple Displacement Amplification (MDA) 法を用いてDNAを増幅した後、IlluminaのビーズアレイなどによりSNP解析を行う。 発表された論文では、ハプロイドごとのSNPが比較的良好に同定できることが示されているが、MDA法によるDNA増幅で極端なバイアスがかかるために、父方のゲノムと母方のゲノムが両方存在するケースでも、領域によっては片方の染色体由来のSNPしか同定できない問題も指摘されている。 図Bのように3分割する方法を用いた場合、計算上は、5回(5個のサンプル)の解析により52％のケースで全ゲノムのハプロタイプが解明できる。8回(8個のサンプル)の解析では93％、12回(12個のサンプル)の解析では99.6％のケースで全ゲノムのハプロタイプが解明できる。 |
Direct Deterministic Phasing (DDP)法
| DDP法は、マイクロ流路を用いて各ハプロイド染色体を分離する方法であり、2011年1月にNature Biotechnology誌に発表された。以下に、その方法の概要を説明する。 (1) 細胞懸濁液をマイクロ流路に流し、顕微鏡法により細胞分裂中期の細胞を分離する。 (2) 分離した細胞分裂中期の単細胞をマイクロ流路中でプロテアーゼで処理することにより、各ハプロイド染色体をバラバラにする（なお、倍化した2本のハプロイドゲノムは依然としてセントロメアで結合している）。 (3) マイクロ流路を用いて、バラバラになった46種類のハプロイド染色体を48本のチャンバーにわける。 (4) 各チャンバーに分離された染色体DNAをMDA法を用いてDNA増幅した後、46-loci Taqman genotyping PCRにより染色体の種類を同定する。 (5) 46の染色体を1対のハプロイドを分離して2群にわけた後、それぞれをIlluminaのビーズアレイなどによりSNP解析を行う。 DDP法はマイクロ流路を用いてハプロイド染色体を分離し、MDA法を用いてDNAを増幅するので、並列処理や自動化が可能なので、大量処理に向いていると思われる。ただし、発表された論文では、細胞分裂中期の細胞の同定は人間の目で行っているので、この同定を自動化することが課題となる。 |
１細胞ゲノムシーケンシングとの組み合わせの可能性
| 上記のいずれの方法も通常のMDA法を用いてDNA増幅を行っているので、増幅される領域に大きなバイアスがかかることが難点である。この問題は、10月12日と24日のGOクラブで紹介した「１細胞からのゲノムシーケンシング」で述べた方法を使えば解決できると思われる。それぞれの方法の論文でも言及されているが、当然のことながら、増幅したDNAを次世代シーケンサーを用いて配列決定を行えば、ハプロイドごとのゲノム配列が得られるはずである。ただし、これらの論文では、ゲノム配列決定までは行っていない。 以上、「7DDNA法またはDDP法のようなハプロイド染色体の分離方法」と「１細胞ゲノムシーケンシング法」を組み合わせることにより、ヒトのハプロイドごとのゲノム配列だけなく、酵母のような真核微生物のゲノムに関しても、ハプロイドごとにゲノム配列を得ることができるであろう。 |